PCR儀的兩大誤區(qū)我們要注意了！

　　PCR儀的兩大誤區(qū)分析：

　　1.儀器通道越多越好

　　隨著PCR技術(shù)的成熟運(yùn)用，熒光定量PCR儀也是如此。從單通道熒光定量PCR儀發(fā)展到如今各個(gè)廠家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀，眼花繚亂的選擇讓人無(wú)所適從，稍不小心就可能走進(jìn)“通道越多越好”的誤區(qū)。

　　在使用有些5通道的熒光定量PCR儀時(shí)，為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性都要在實(shí)驗(yàn)中使用ROX(一種熒光染料)，這些熒光染料都必須單獨(dú)使用一個(gè)檢測(cè)通道。這樣以來(lái)，真正能檢測(cè)多重PCR熒光信號(hào)的有效通道只有4個(gè)，而且使用校正染料可能會(huì)增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測(cè)通道是只為自已廠家的專用的熒光染料或試劑開放的，有效檢測(cè)通道也絕非像宣傳的那么多。因此在購(gòu)買前確認(rèn)熒光定量PCR儀器的有效檢測(cè)通道尤為重要。

　　2.real-time PCR儀無(wú)需梯度功能

　　對(duì)于使用染料法的定量PCR反應(yīng)，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計(jì)軟件或者經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算熔解溫度(Tm值)，但運(yùn)用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會(huì)很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對(duì)于特殊片斷，經(jīng)驗(yàn)公式得到的數(shù)據(jù)不一定能得出準(zhǔn)確的結(jié)果，退火溫度細(xì)微的差異對(duì)結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問(wèn)題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問(wèn)題-在反應(yīng)過(guò)程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在規(guī)定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出適合的反應(yīng)條件。

　　不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化-對(duì)于多種聚合酶混合酶擴(kuò)增來(lái)說(shuō)這個(gè)非常重要，因?yàn)門aq和校正酶的佳反應(yīng)溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。

　　使用有梯度功能的熒光定量PCR儀可以一次完成以往多次實(shí)驗(yàn)才能完成的優(yōu)化過(guò)程，簡(jiǎn)化了摸索PCR反應(yīng)條件的繁瑣實(shí)驗(yàn)，既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間提高效率，又節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。