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脂質(zhì)-配體相互作用工具:脂質(zhì)不再是可怕的中間體

發(fā)布時間: 2023-09-08  點擊次數(shù): 1101次



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      當細胞生物學(xué)家第一次發(fā)現(xiàn)可能有一種脂質(zhì)參與他們最喜歡的途徑時,這有點像在馬路對面找到一堵墻(就像當脂質(zhì)學(xué)家在他們的路上找到一種蛋白質(zhì)一樣……)。

      由于脂質(zhì)的不同性質(zhì),大多數(shù)細胞生物學(xué)家都害怕在他們的研究過程中不得不面對這種情況。好消息是,有一些簡單的方法可以幫助克服這一障礙,使研究特定途徑中的脂質(zhì)變得更容易。在這里,我想介紹一些脂配體相互作用研究的分析和準備工具。


1 覆蓋試驗Overlay assays-鑒定與給定蛋白質(zhì)相互作用的脂質(zhì)


      這些分析方法允許鑒定一種或多種脂質(zhì)與給定蛋白質(zhì)相互作用。

      與Western-blot原理類似,它們的原理是在表面涂上各種類型的脂質(zhì),這些脂質(zhì)將與已知的蛋白質(zhì)接觸,這種蛋白質(zhì)將被標記或抗體臨時檢測到。脂質(zhì)的載體通常是硝化纖維素膜(圖1)。與點印跡法一樣,需要優(yōu)化一些實驗參數(shù)(如緩沖液、蛋白質(zhì)純化或蛋白質(zhì)濃度)。

      當可用蛋白質(zhì)的數(shù)量有,小的“覆蓋分析格式"可以用少于0.5 mg的蛋白質(zhì)進行檢測。這是一種簡單的方法來測試一種感興趣的蛋白質(zhì)對各種脂質(zhì)的結(jié)合能力!

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      為了檢查蛋白質(zhì)對各種類型的脂質(zhì)的相對親和力,硝基纖維素陣列被標記為每種脂質(zhì)的梯度。幾個相同的陣列可以證明在測試單特異性或多特異性蛋白質(zhì)有用。該技術(shù)顯示出高特異性(圖2),結(jié)果甚至比ELISA試劑盒更干凈,再次強調(diào)了實驗條件優(yōu)化的必要性。



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      對于那些對膜不熟悉的人,或者正在研究大量蛋白質(zhì)的人,也可以使用聚苯乙烯板,用各種類型的脂質(zhì)共價涂覆(稱為COVA板)。用于高含量篩選的微陣列板格式允許您在單個板上測試具有不同脂質(zhì)的幾種蛋白質(zhì)(親和性)。平板的每孔都有9種不同的脂質(zhì),用于檢測先前標記或通過免疫檢測的蛋白質(zhì)。圖3所示的是一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(已知與兩種不同的脂質(zhì)相互作用)。對于前面介紹的設(shè)置,需要優(yōu)化蛋白質(zhì)濃度。



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2 下拉試驗Pull-down assays-發(fā)現(xiàn)一種已知脂質(zhì)的蛋白質(zhì)伙伴


      對于相反的實驗設(shè)置,當您想要識別已知脂質(zhì)的蛋白質(zhì)伴侶時,瓊脂糖為基礎(chǔ)的下拉試驗等制備技術(shù)將是您的選擇:

*瓊脂糖珠包被確定的脂質(zhì)可以被進一步孵育與細胞裂解液,上清液,重組蛋白…

* 然后相互作用的復(fù)合體通過離心將它們拉下來。

       它允許分離脂質(zhì)結(jié)合蛋白的數(shù)量適合進一步鑒定和表征。它經(jīng)常與細胞裂解液一起用于“撈出"脂質(zhì)對偶物(圖4)。

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3 漂浮試驗Floatation assays-用于更高特異性的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用


       當你在尋找更高特異性的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用時,另一種基于脂質(zhì)富集脂質(zhì)體(用作脂質(zhì)/配體相互作用的基質(zhì)支持)的制備方法是可用的。

       與GEM脂筏提取(葡萄糖梯度超離心)類似,脂質(zhì)體預(yù)結(jié)合到脂質(zhì)配體上,將沿著超離心制備的葡萄糖梯度分成幾個部分分布(圖5)。

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這些富脂脂質(zhì)體有許多優(yōu)點:

*聚脂質(zhì)體PolyPIPosomes是聚合的脂質(zhì)體,

*增加穩(wěn)定性(長達6個月),

*生物素標簽,方便鏈霉親和素檢測,

*尺寸均勻(~200 nm),可進行浮選試驗,

*這些脂質(zhì)體也可用于:表面等離子體共振,脂質(zhì)體覆蓋分析,ITC。


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